Как работают криобанки

Иногда требуется хранить биоматериал в течение длительного времени. Криоконсервация – отличный способ решения этой задачи. Чаще всего возникает необходимость хранить бактериальную культуру (например, в исследовательских целях) или клетки (биоптат) – так хранят, например, культуру фибропластов для проведения SPRS-терапии. Обычно используются морозильные камеры со сверхнизкими температурами (технология ULT – ultra-low temperature freezers). Так, сохранение бактериальных культур при температуре -80 ºC может обеспечить их жизнеспособность в течение более пяти лет. 

Однако применение столь низких температур при замораживании может вызвать некоторые проблемы. Вода при замерзании расширяется, что приводит к образованию кристаллов льда. Как само расширение, так и образование кристаллов могут привести к фатальным повреждениям клеток и, как следствие, к их гибели.

По этой причине, прежде чем подвергать клетки сверхнизким температурам, их необходимо защитить от кристаллизации воды.

Кристаллы льда убивают клетки

Замерзание воды неизбежно вызывает кристаллизацию. При охлаждении до низких температур молекулы воды располагаются упорядоченно, образуя кристаллы льда. Эти кристаллы могут иметь заостренные концы и острые края, способные пробить клеточные стенки и мембраны, вызывая структурные повреждения и смерть клеток.

Образование кристаллов льда также может обезвоживать клетки. Внеклеточный лед образуется намного быстрее, чем внутриклеточный. В результате снаружи клеток концентрация растворенных веществ начинает увеличиваться, значительно превосходя концентрацию внутри, где сохраняется больше воды в жидком виде.

Затем осмос выталкивает внутриклеточную воду, в результате чего клетки сморщиваются и высыхают. Концентрация растворенных веществ внутри клеток резко возрастает. Она становится токсичной. Это ещё одна из причин гибели клеток наравне с обезвоживанием.

Криопротекторы

Чтобы криоконсервация работала должным образом, крайне важно предотвратить образование кристаллов льда. Для этого часто используются криопротекторы, такие как диметилсульфоксид (ДМСО) или глицерин. Эти вещества препятствуют образованию кристаллов льда при глубокой заморозке, позволяя избежать как механического повреждения, так и обезвоживания клеток.

Для разных образцов требуются разные типы криопротекторов. Для бактериальных культур обычно используют глицерин. Для клеточных культур рекомендуемым криопротектором является ДМСО.

Оживление клеток

Использование криоконсервированных клеток предполагает их возвращение в биологически активное состояние. Протоколы могут различаться – в зависимости от того, какой криопротектор применялся при криоконсервации.

Например, при оживлении бактерий, замороженных с помощью глицеринового раствора, важно, чтобы все стадии процесса исключали оттаивание. Оттаивание может повредить бактериальные клетки, препятствуя их росту и размножению в культуре.

При использовании ДМСО необходимо нагревать культуры на водяной бане при 37 ºC в течение нескольких минут до оттаивания. Затем их переносят в свежую культуральную среду; клетки следует промыть, чтобы вымыть ДМСО. Если криопротектор не будет удален достаточно быстро, это может привести к повреждению клеток.

Поддержание жизнеспособности клеток

Для сохранения жизнеспособности клеток в течение многих лет необходимо обеспечить постоянную температуру хранения криоконсервированных образцов. Каждое повторение разморозки и заморозки повышает вероятность их повреждения. Поэтому морозильные камеры открываются только тогда, когда образец должен быть изъят.